نکات مهم کنترل کيفيت در آزمايشهاي ميکروب شناسی

برای کنترل کيفيت در آزمايشگاه ميکروب شناسی بايد به موارد زير توجه داشت:
کنترل کيفيت آزمايشهاي تعيين حساسيت ميکروبي، محيط هاي کشت، رنگها ومعرفها، ابزار و
دستگاهها(لوپ، فور، اتوکلاو وانکوباتور)
نظر به اينکه هدف نهايي کليه فعاليت هاي آزمايشگاه ميکروب شناسی انتخاب مناسبترين آنتي بيوتيک جهت درمان بيمار مبتلا به عفونت ميباشد ، بعد ازمبحث شيوه نگهداري و استفاده ازسويه هاي باکتريايي که براي مک فارلند / کنترل کيفيت کليه مواد در آزمايشگاه ميکروب شناسی مورد نيازهستند در ابتدا طرز تهيه کدورت ۵ براي استاندارد سازي سوسپانسيون ميکروبي لازم جهت تلقيح در محيط مولر هينتون آگار و نيز روش انجام آزمايشهاي تعيين حساسيت ميکروبي و کنترل کيفي آنها ذکر گرديده است.
سپس به دليل قرار داشتن آزمايش هاي ادراري در زمره شايعترين آزمايشهاي روتين، کنترل کيفيت لوپ ادراري آورده شده است.
جزوه حاضر شامل مهم ترين اجزاي کنترل کيفيت براي کليه آزمايشگاههادر هر سطح مي باشد و ساير مباحث درنوبتهای بعدی ارائه خواهند شد.

نگهداري و استفاده از سويه هاي باکتريايي

براي نگهداري سويه هاي باکتريايي مي توان از روشهاي طولاني مدت و کوتاه مدت استفاده نمود.
نگهداري طولاني مدت
نگهداري طولاني مدت باکتريها اين امکان را مي دهد که کليه سويه هاي ميکروبي اعم از هوازي (بارشد سريع ويا سخت رشد) ونيز بيهوازي ، ماهها و حتي سالها به صورت زنده نگهداري شوند. بهترين روشهاي و نگهداري در دماي ۷۰ – درجه سانتي گراد يا (Freeze drying) نگهداري طولاني مدت شامل ليوفيليزاسيون پايين تر ( در ديپ فريز يا در نيتروژن مايع ) مي باشد.
۱- نگهداري در ديپ فريز ( ۵۰ – تا ۷۰ – درجه سانتي گراد يا پايينتر) ويا نيتروژن مايع :
5 % حاوی TSA ( Trypticase Soy Agar ) باکتري مورد نظر را روي محيط مغذي مانند پليت خون گوسفند و در مورد ميکروارگانيسمهاي سخت رشد روي محيط آگار شکلاته کشت دهيد. پليتها را به مدت براي هر باکتري انکوبه CO ۳۵ درجه سانتي گراد و در صورت نياز تحت شرايط 2 ± ۱۸ ساعت در دماي ۲ -۲۴ نمائيد.
بعد از انکوباسيون، خالص بودن و مورفولوژي کلني ها را بررسي نموده و در صورت نياز، تستهاي
۵۰ ميلي ليتر از يک – بيوشيميايي آنرا انجام دهيد. سپس از باکتري رشد يافته ، سوسپانسيون غليظي در ۱۰۰

تهيه نمائيد. اين محيط براي جلوگيري از تخريب سلولهاي (Cryoprotective ) محيط محافظت کننده از سرما
خون ، Skim milk باکتري در شرايط انجماد مورد استفاده قرار مي گيرد. محيط محافظت کننده از سرما مي تواند
%۱۰- حاوي گليسرول با غلظت نهايي ۱۵ Tryptic Soy Broth (TSB) گوسفند يا خرگوش دفيبرينه استريل يا
باشد.
۰ در ويالهاي شيشه اي يا پلاستيکي کوچک /۵ -۱ mL سپس از سوسپانسيون باکتريايي فوق به مقدار
استريل توزيع کنيد . تعداد ويال ذخيره خود را براي مصرف يکسال آماده نمائيد.
ويالهاي حاوي سويه ها را مي توان در برودت ۵۰ – تا ۷۰ – درجه سانتي گراد به مدت يکسال نگهداري
نمود. در صورت عدم دسترسي به فريزر ۷۰ – درجه مي توان سويه هاي با رشد سريع را در فريزر ۲۰ – درجه
نيز نگهداري نمود. در اين شرايط توجه به نکات زير ضروري است.
سويه هاي سخت رشد مانند هموفيلوس انفلوآنزا و نيسريا گنوره در اين دما قابل نگهداري نمي باشند و
بايد در فريزر ۷۰ – درجه نگهداري شوند.
سويه هاي بارشد سريع در اين دما عمر کمي دارند و تعداد زيادتري از آنها از بين مي روند. بنابراين
توصيه مي شود براي اطمينان از حيات سويه ها هر چند ماه ، طبق روش زير کشت داده شوند.
يک ويال از فريزر بيرون آورده و و سريعا زير آب جاری ولرم محتويات آنرا ذوب نمائيد. نمونه را
۱۸ ساعت در – روي محيط آگار خوندار يا شکلاته ( در مورد باکتريهاي سخت رشد ) تلقيح کرده و به مدت ۲۴
انکوبه نماييد. اين باکتري مي تواند براي آزمايشهاي کنترل CO ۳۵ درجه ودر صورت نياز در شرايط 2 ± دماي ۲
بکار رود. قبل از هر اقدام بايد از خالص بودن working control داخلي کيفيت در آزمايشگاه يا براي تهيه
نمونه ، اطمينان حاصل کرد. ويال مورد استفاده بعد از ذوب شدن بايد دور انداخته شده و بهيچوجه مجددا
فريز نگردد.
عبارتست ازکشت مجدد از کشت ذخيره فريز شده که براي کنترل کيفيت : working control کشتهاي
محيط کشت و.. استفاده مي شود.
از کشت ذخيره تا ۳ پاساژ پشت سر هم مي توان انجام داد . پس از آن ، نمونه بايد دور انداخته شده و
استفاده شود. پاساژهاي مکرر( working control از يک کشت ذخيره فريز شده ديگر براي تهيه کشتهاي
بيش از ۳ پاساژ)، احتمال تغيير فنوتيپي سويه ها را افزايش مي دهد.
از کشت ذخيره فريز شده ، روي پليت يا آگار شيبدار تلقيح و آنرا به ، working control براي تهيه
مدت يک شبانه روز تا زماني که رشد مناسبي بدست آيد، انکوبه نمائيد. در مورد ارگانيسمهاي با رشد سريع اين
۲ درجه سانتيگراد يا در دماي اتاق تا مدت ۴ هفته نگهداري نمود. بعد از هر – پليت يا آگار شيبدار را مي توان در ۸
پاساژ، خالص بودن و مورفولوژي کلني ها را بررسي نمائيد.
۲- استفاده از روغن معدني در دماي اتاق :

را با شيب کم در لوله تهيه نماييد. براي Brain Heart Infusion Agar (BHIA) ۱- محيط کشت
باکتريهاي مشکل پسند مانند گونوکک ، مننگوکک ، استرپتوکک پنومونيه و هموفيلوس آنفلوانزا ، لازم است محيط
شکلات آگار را با افزودن ۵% خون گوسفند به محيط فوق پس از خروج از اتوکلاو و رسيدن به دمای ۵۰ درجه
سانتی گراد و قرار دادن در بن ماري ۸۰ درجه سانتي گراد به مدت ۱۵ دقيقه تهيه نمود.
۲- روغن معدني ( يا پارافين مايع ) را در حرارت خشک ( ۱۷۰ درجه سانتي گراد به مدت يکساعت )
استريل نمائيد.
۳- ميکروب مورد نظر را روي محيط کشت دهيد.
۱ روي سطح محيط بريزيد. cc ۴- بعد از بدست آوردن کشت کافي ، روغن استريل را به مقدار
۵- در صورت نياز به کشت مجدد ، نمونه از سطح آگار (زير روغن ) برداشته مي شود.
۶ ماه تجديد کشت نماييد. – ۶- بعد از ۱۲
۱- کشت عمقي و نگهداري در دماي اتاق :
اين روش فقط براي باکتريهايي که مشکل پسند نيستند مانند استافيلوکک وخانواده انتروباکترياسه بکار
مي رود.
را باعمق زياد در لوله تهيه نماييد. TSA ۱- يک محيط کشت آگار بدون کربوهيدرات مانند
۲- باکتري را بصورت کشت عمقي در در اين محيط تلقيح نماييد.
۳- اين محيط را ۲۴ ساعت در اتو ۳۵ درجه انکوبه نمائيد.
۴- در لوله را با درپيچ يا چوب پنبه ببنديد.
۵- لوله در پيچ دار را در پارافين مايع فرو ببريد به گونه اي که کاملا در لوله را بپوشاند.
۶- کشتها را در حرارت اتاق نگهداري نمائيد.
۷- هرساله سوش موردنظر را تجديد نمائيد.
براي نيسريا و (CTA) ۲- کشت عمقي در محيط سيستين تريپتيکيس آگار
استرپتوکک :
را در لوله تهيه نماييد . CTA ۱- محيط
۲- باکتري را بطو عمقي در اين محيط کشت دهيد.
۳- محيط را بمدت ۲۴ ساعت در اتو ۳۵ درجه سانتي گراد انکوبه نماييد.
۴- در لوله را با چوب پنبه يا در پيچ ببنديد.
۵- لوله در پيچ دار را در پارافين مايع فرو ببريد به گونه اي که کاملا در لوله را بپوشاند.
۶- براي نيسريا لوله را در ۳۵ درجه نگهداري و هر دو هفته کشت را تجديد نمائيد . براي استرپتوکک
لوله را در حرارت اتاق نگهداري کرده و هر ماه تجديد کشت کنيد.
براي باکتريهاي بيهوازي : Cooked meat ۳- محيط کشت
کشت دهيد. Cooked meat ۱- باکتري را در لوله هاي حاوي محيط
۲- محيط را بمدت ۲۴ ساعت در اتو ۳۵ درجه سانتي گراد انکوبه نماييد.
۳- در لوله را با چوب پنبه يا در پيچ ببنديد.
۴- کشتها را در حرارت اتاق نگهداري نمائيد.
۵- هردو ماه کشت را تجديد نمائيد.
نگهداري کوتاه مدت
که براي کارهاي روتين روزانه استفاده مي شوند ، به روشهاي زير تهيه working control کشتهاي
مي شوند:
باکتريهاي با رشد سريع §
لوله اي درپيچ دار کشت دهيد. TSA ۱- سوش مورد نظر را در سطح محيط
۲- محيط را بمدت ۲۴ ساعت در اتو ۳۵ درجه سانتي گراد انکوبه نماييد.
۳- پس از رشد کامل، لوله را در يخچال نگهداري کنيد
۴- هر ماه کشت را تجديد نمائيد.
استرپتوککها §
۱- سوش مورد نظر را در سطح آگار خوندار شيبدار( لوله اي درپيچ دار) کشت دهيد.
۲- محيط را بمدت ۲۴ ساعت در اتو ۳۵ درجه سانتي گراد انکوبه نماييد.
۳- پس از رشد کامل، لوله را در يخچال نگهداري کنيد. ( جهت استرپتوکک پنومونيه ، محيط را در دماي
اتاق نگهداري کنيد.)
۴- هر ماه کشت را تجديد نمائيد.
مننگو کک و هموفيلوس §
۱- سوش مورد نظر را در سطح محيط آگار شکلاته لوله اي يا پليت کشت دهيد.
۲- محيط را بمدت ۲۴ ساعت در اتو ۳۵ درجه سانتي گراد انکوبه نماييد.
۳- پس از رشد کامل، لوله را در حرارت اتاق نگهداري کنيد
۴- هر ۲ هفته کشت را تجديد نمائيد.
گونوکک §
۱- سوش مورد نظر را در سطح محيط آگار شکلاته کشت دهيد.
۲- محيط را بمدت ۲۴ ساعت در اتو ۳۵ درجه سانتي گراد انکوبه نماييد.
۳- نمونه را در دماي ۳۵ درجه نگهداري نماييد.
۴- هر ۲ روز يکبار کشت را تجديد نمائيد.
تهيه کدورت نيم مک فارلند
براي استاندارد کردن غلظت تلقيح براي آزمايش تعيين حساسيت، بايد از استاندارد سولفات باريم
که براي تهيه آن به روش زير عمل مي شود ، استفاده نمود. (BaSo4)
۹۹ / را به ۵ ( W/V BaCl2/H2O 1.175% ) 0.048 mol/L( BaCl ۰ ميلي ليتر از کلرور باريم ( 2 /۵
1% ) اضافه کنيد و با هم زدن مداوم يک سوسپانسيون تهيه V/V) 0.18 mol/L ميلی ليتراسيد سولفوريک
نمائيد.
چگالي صحيح استاندارد با تعيين جذب اين سوسپانسيون توسط اسپکتروفتومتر در کو وت به قطر ۱
۰ باشد. / ۰ تا ۱۳ / سانتی متر تعيين مي شود. جذب در ۶۲۵ نانومتر بايد بين ۰۸
۴ ميلي ليتر در لوله هاي درپيچ دار هم اندازه با لوله هاي سوسپانسيون – از سوسپانسيون حاصله ۶
باکتريايي ريخته مي شود.
در لوله ها محکم بسته شده و در دماي اتاق نگهداري مي شوند.
قبل از هر بار استفاده ، استاندارد با ورتکس مکانيکي به شدت همزده مي شوند تا کدورت يکنواختي
بدست آيد. در صورت مشاهده ذرات بزرگ ، بايد استانداردتازه ای جايگزين شود.
استاندارد سولفات باريم ، بايد بصورت ماهانه جايگزين گرديده يا جذب آن اندازه گيری شود.
کنترل کيفيت ديسک هاي آنتي بيوتيک جهت انجام آزمايش تعيين
disk diffusion agar حساسيت ميکروبي به روش
هدف
هدف از برنامه کنترل کيفي پايش و ارزيابي موارد زير مي باشد :
صحت و دقت روش انجام آزمايش تعيين حساسيت ·
مواد و وسايل به کار برده شده در اين آزمايش ·
عملکرد افرادي که آزمايش را انجام داده و نتايج بدست آمده را قرائت مي نمايند. ·
به منظور دست يابي بهينه به اين اهداف در دسترس داشتن سويه هاي کنترل کيفي تهيه شده از مراکز
معتبر ضروري است .
عبارتند از: CLSI سويه هاي کنترل کيفي پيشنهادي توسط
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Escherichia coli ATCC 25922
@wwwlabworldir
Escherichia coli ATCC 35218
Haemophilus influenzae ATCC 49247
Haemophilus influenzae ATCC 49766
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
فقط به عنوان يک ميکروارگانيسم کنترلي براي ترکيبات ممانعت کننده E.coli ATCC 35218
بتالاکتاماز، مثل ترکيبات حاوي کلاولانيک اسيد، سولباکتام يا تازوباکتام پيشنهاد مي شود .
براي ارزيابي محيط ( E.faecalis ATCC يا 33186 ) Enterococcus faecalis ATCC 29212
مولر هينتون آگار با ديسک تري متوپريم / سولفامتوکسازول استفاده مي شود. درمحيط کشت قابل قبول ، هاله
۲۰ يا بزرگتر ايجاد مي شود در حاليكه در محيطهاي کشت غير قابل قبول ، هاله mm عدم رشد واضحي به قطر
۲۰ ايجاد mm عدم رشد ايجاد نمي شود يا در داخل هاله ، رشد کم مشاهده مي شود و يا هاله اي با قطر کمتر از
ميگردد. اين کار به منظور بررسي مقادير غير قابل قبول تيميدين در محيط کشت مزبور است .
همچنين براي کنترل ديسکهاي آمينو گليکوزيد با دوز Enterococcus faecalis ATCC 29212
بالا به کار مي رود.
به ESBL به عنوان يک سويه کنترلی براي آزمايشات Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
کار برده مي شود .
کنترل کيفيت قطر هاله عدم رشد سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکي
و با استفاده از همان مواد disk diffusion سويه هاي کنترل کيفي را بايد به روش استاندارد آزمايش
و روشي که براي سويه هاي جدا شده از نمونه هاي کلينيکي استفاده مي شود آزمايش و نتايج را با جداول ۳ و
ضميمه ۳) مقايسه و بررسي نمود . محدوده قطر هاله عدم رشد قابل قبول براي هر سويه کنت رلي ) CLSI ۳A
نسبت به يک ديسک آنتي بيوتيکي در جداول فوق فهرست شده است .
چنانچه تغيير در ميانگين قطر هاله عدم رشد ناشي از خطا در روش انجام آزمايش نباشد ، احتمالا ”
ناشي از تغيير در حساسيت ذاتي باکتري نسبت به آن آنتي بيوتيک مي باشد . در اين صورت لازم است کشت
تازه از سوش کنترل تهيه شود .
آزمايش کنترل کيفيت را بايد درچه فواصل زماني انجام داد ؟
الف _ انجام آزمايش روزانه
براي هر سويه کنترلي با يک ديسک آنتي بيوتيکي بايد ۲۰ روز متوالي آزمايش تعيين حساسيت انجام و نتايج با
مقادير قابل قبول اشاره شده در جداول فوق مقايسه گردد . بر اساس ضريب اطمينان ۹۵ % تنها يک مورد از ۲۰
نتيجه قرائت شده مي تواند خارج از محدوده كنترل باشد ( به ضميمه ۲مراجعه کنيد) . چنانچه بيشتر از يک مورد
خارج از محدوده کنترل باشد نياز به اقدامات اصلاحي خواهد بود ، که در ادامه توضيح داده مي شود.
ب _ انجام آزمايش هفتگي
– در صورتيكه تنها يک مورد از ۲۰ نتيجه قطر هاله عدم رشد براي هر سويه کنترلي / ديسک آنتي
۳( ضميمه ۳) قرار گيرد ، کنترل کيفي روزانه را به A بيوتيکي خارج از محدوده قابل قبول مندرج در جداول ۳ و
هفتگي تغيير دهيد( به ضميمه ۲ مراجعه کنيد) .
– آزمايش کنترل کيفي هفتگي را يکبار در هفته و هم چنين زمانيکه يکي از عوامل آزمايش (مانند سري
ساخت آگار يا ديسکهای تهيه شده از يک سازنده) تغيير کند، انجام دهيد .
اگر هر يک از نتايج کنترل کيفي هفتگي خارج از محدوده قابل قبول باشد ، انجام اقدامات اصلاحي
مورد نياز است .
( Corrective actions) اقدامات اصلاحي
الف _ نتايج خارج از محدوده قابل قبول به دليل خطاهاي مشهود و واضح شامل:
– استفاده از ديسک اشتباه
– استفاده از سويه کنترلی اشتباه
– آلودگي واضح سويه
– استفاده غيرعمدی از دما و شرايط اشتباه انکوباسيون
بوجود آمده است . دراين حال بايد دليل ايجاد خطا مکتوب و پس از اصلاح آزمايش دوباره تکرار شود
. اگر نتايج گزارش شده در محدوده مورد نظر قرار گرفت ، عمليات اصلاحي بيشتري مورد نياز نمي باشد .
ب _ عامل ايجاد نتايج خارج از محدوده کنترل نامشخص است . در اين حال بايد اقدامات اصلاحي
فوري بشرح زير انجام شود.
– آزمايش را جهت يک سويه کنترلي / ديسک آنتي بيوتيکي براي ۵ روز متوالي تکرار و
همه نتايج را ثبت کنيد .
۳( ضميمه ۳) و در محدوده قابل قبول A – اگر اندازه هر ۵ قطرهاله مطابق جداول ۳ و
باشد ، عمليات اصلاحي بيشتري مورد نياز نمي باشد .
– اگر اندازه هر يک از ۵ قطر هاله عدم رشد خارج از محدوده قابل قبول باشد ، به
عمليات اصلاحي اضافي نياز است .
– آزمايشهاي کنترلي روزانه بايد ادامه داده شود تا به دليل نهايي مشکل پي برده شود .
عمليات اصلاحي اضافي :
وقتي عمليات اصلاحي فوري مشکل را حل نکرد ، احتمالا” خطاي مشاهده شده بعلت بروز يك اشکال
کلي در سيستم و نه يک خطاي تصادفي ايجاد شده است . در اين حالت بايد موارد بيشتري بررسي شوند.مانند:
– اندازه گيري و ثبت صحيح قطر هاله هاي عدم رشد
– رعايت تاريخ انقضا و شرايط نگهداري ديسکها و مواد مورد استفاده ( دور از رطوبت
و در دماي مناسب)
– مناسب بودن دما و اتمسفر انکوباتور
– تغييرنيافتن يا آلوده نبودن سويه هاي کنترل
– مطابقت صحيح سوسپانسيون تلقيح با استاندارد نيم مک فارلند
– استفاده از پليت کشت تازه برای تلقيح ( پليت کشت بايد تازه بوده و مدت زمان
انكوباسيون آن بيشتر از ۲۴ ساعت ، نباشد. )
وقتي مشکل بر طرف شد ، می توان کنترل کيفي هفتگي را برقرار کرد.
نگهداري ديسکهاي آنتي بيوتيکي
۱۴ – و پايين تر تا زمان مصرف نگهداري ˚C ۸ و پايين تر ، يا در فريزر ˚C – ديسکها بايد در يخچال
شوند.
– تمامي ديسکهاي گروه بتالاکتام مانند پني سيلين ، آمپي سيلين ، ک ربني سيلين ، تيکارسيلين ،
اگزاسيلين و نسل اول ، دوم و سوم سفالوسپورين ها و … بايد در فريزر نگهداري شوند ، و فقط مي توان مقداري
از آن را بر اساس کار روزانه آزمايشگاه حداکثر به مدت يک هفته در يخچال نگهداري نمود .
– بعضي آنتي بيوتيکهاي حساس مثل ايميپنم ، سفاکلر و ترکيبات کلاولانيک اسيد يا سولباکتام اگر تا
هنگام مصرف در فريزر نگهداري شوند ، پايداري بيشتري خواهند داشت .
– ديسکها بايد در ظروف داراي درپوش محکم و حاوي مواد جاذب رطوبت نگهداري شوند .
– ديسکهای آنتي بيوتيکي بايد يك تا دو ساعت قبل از استفاده از يخچال يا فريزر خارج شوند تا به
درجه حرارت اتاق برسند .
روش تعيين حجم لوپ
براي شمارش کلني هاي بدست آمده از کشت نمونه هاي بالينی بويژه ادرار به منظور تشخيص عفونت
لازم است از لوپهاي استاندارد با حجم معين استفاده شود. آزمايشگاه مي بايست همواره از لوپهاي کاليبره جهت
را گزارش نمايد. ( CFU/ml) کشت نمونه هاي ادراري استفاده وتعداد کلني هاي موجود در هر ميلي ليتر ادرار
براي بررسي حجم لوپ از روشهايي مانند رنگ سنجي و توزين استفاده مي شود. ساده ترين روش
براي بررسي حجم لوپ استفاده از روش رنگ سنجي از طريق اسپکتروفتومتر يا فتومتر به کمک مواد رنگي مانند
متيلن بلو ، کريستال ويوله و اوانس بلو مي باشد. در اين دستورالعمل روش رنگ سنجي با استفاده از اوانس بلو
توضيح داده شده است.
ابزار و مواد مورد نياز تعيين حجم لوپ با استفاده از ماده رنگي اوانس بلو
اين ماده به صورت پودر تجاري قابل دسترس بوده و به . (Evans Blue) ۱- پودر اوانس بلو
آساني در آب حل مي شود.
۲- آب مقطر
۳- لوله آزمايش
۴- پيپت يا سمپلر
۵- اسپکتروفتومتر يا فتومتر کاليبره
۶- کاغذ ميليمتري
روش انجام
20 از پودر رنگي اوانس بلو را در ۱۰ ميلي ليترآب حل نماييد. غلظت اين محلول mg -۱
0.2 مي باشد. g/100
1 آب ml 2 ودر هر يک از لوله هاي باقيمانده ml ۶ لوله آزمايش انتخاب کرده ، در لوله اول -۲
0.2 ) برداشته در لوله اول ريخته و کاملا g/ 0.02 ) از محلول ذخيره اوليه ( 100 ml) مقطر بريزيد. 20 لاندا
1 از لوله اول برداشته و در لوله دوم بريزيد ، از لوله دوم ، در لوله سوم و اين عمل را ml مخلوط نماييد. سپس
تا آخر ادامه دهيد. در انتها يک ميلي ليتر از لوله ششم را برداشته و دور بريزيد . به اين ترتيب ۶ محلول خواهيد
داشت که رقت نهايي بدست آمده در هر يک و ميزان ماده رنگي موجود در آن بشرح زير خواهد بود.
0.2g/ 20 از محلول ذخيره 100 λ
رقت
10 مقدار ماده رنگی λ 5 λ 2.5λ 1.25λ 0.625λ 0.3125λ
هر يک از ۶ محلول حاصله را به کمک اسپکتروفتومتر در طول موج (OD) ۳- ميزان جذب نوري
620 بدست آوريد. nm
۴- جهت تعيين حجم لوپ مورد بررسي ، ۱۰ لوله آزمايش برداشته و در هر يک ۱ ميلی ليتر آب
مقطر بريزيد.
۵- لوپ تحت کنترل را بطور کاملا عمودي وارد محلول ذخيره اوليه نموده ، از محلول رنگی
برداشته و در لوله های آزمايش فرو بريد . اين کار را ۱۰ بار تکرار و در فواصل لوپ را روي کاغذ خشک کن
قرار دهيد تا کاملا خشک شود. از سوزاندن لوپ خودداري نماييد.
620 قرائت نمائيد. nm ۶- بعد از مخلوط کردن ، جذب هريک از لوله ها را در طول موج
۷- بر روي کاغذ ميلي متري نموداري ترسيم نماييد که در آن ، محور افقي نشانگر رقتهاي تهيه
( شده و محور عمودي نمايانگر جذب نوري هر رقت باشد. ( مشابه ضميمه ۴
۸- با قرار دادن ميانگين جذب بدست آمده از لوپ کنترلي، روي محور عمودي مي توان ضريب
رقت لوپ کنترلي را از روي محور افقي بدست آورد.
جهت تعيين تعداد کلني در هر ميلي ليتر ادرار ، بايد تعداد کلني هاي بدست آمده از کشت روي پليت را در
۱ و تعداد کلني هاي روي / عکس ضريب رقت لوپ ، ضرب کرد. بطور مثال اگر ضريب رقت لوپ مجهول ۱۰۰
۵۰ گزارش نمود. /۰۰۰ cfu/ml پليت ۵۰۰ عدد باشد ، بايد ۵۰۰ را در ۱۰۰ ضرب و نتيجه را بصورت
روشهای ديگری نيز برای بررسی ميزان حجم برداشتی توسط لوپ باکتريولوژی وجود دارد که از بين
آنها می توان به روش توزينی مندرج در کتاب
Diagnostic microbiology ,Elmer W.Koneman, 5th edition, page 96
اشاره کرد که در آن با استفاده از ترازوی بسيار حساس تغييرات وزن ديسک کاغذی بعد از افزودن يک لوپ
آب مقطر روی آن، محاسبه می گردد.